Изучение токсичности и опасности дезинфицирующих средств при ингаляционном воздействии

Введение

В противоэпидемической практике средства дезинфекции являются важнейшим инструментом обеспечения эффективной неспецифической профилактики распространения инфекционных болезней через различные объекты, которые могут быть факторами передачи возбудителей от источника инфекции к человеку. Для обеззараживания широко применяют спирты, альдегиды, бигуанидины, галогенвысвобождающие агенты, галогенфенолы, кислородсодержащие средства, четвертичные аммониевые соединения (ЧАС), фенолы, а также хлора диоксид. Дезинфицирующие средства можно разделить на две большие группы: окисляющие и неокисляющие средства [1].

Диоксид хлора является сильным окислителем и эффективным дезинфицирующим средством. Благодаря широкому антимикробному спектру, низкому образованию галогенированных побочных продуктов диоксид хлора широко используется для очистки воды, в качестве отбеливающего средства, для создания безопасных условий хранения пищевых продуктов, дезинфекции поверхностей различных объектов в медицинских, общественных и других организациях. Механизм действия диоксида хлора заключается в разрушении структуры клеточной мембраны бактерий и грибков, приводящем к изменению её проницаемости и выходу внутриклеточных включений, что приводит к гибели этих микроорганизмов. Гибель вирусов происходит за счёт разрушения капсидов вирусных белков и деградации фрагментов РНК [2–5]. Так, коммерческое дезинфицирующее средство с содержанием диоксида хлора 100 мг/л было эффективно против Escherichia coli и Staphylococcus aureus на поверхностях цеха по производству и переработке пищевых продуктов со снижением более чем на 3,00 log₁₀ колониеобразующих единиц/см² при времени воздействия 15 минут [6].

Из-за своих биоцидных свойств дезинфицирующие средства строго регулируются во всем мире для обеспечения безопасности человека и окружающей среды [7]. Согласно различным сообщениям, воздействие дезинфицирующих средств может негативно сказываться на здоровье человека и животных, в том числе вызывать раздражение верхних и нижних дыхательных путей, воспаление, отёк, изъязвление и аллергические реакции [8].

Цель исследования — установить токсичность и безопасность применения рабочих растворов дезинфицирующих средств с различным содержанием диоксида хлора.

Материалы и методы

Изучены два дезинфицирующих средства, которые образуют диоксид хлора при смешивании двух компонентов.

Средство № 1 состоит из порошка А (смесь хлорита натрия 81%-го и стабилизирующих добавок) и порошка Б (смесь лимонной кислоты 85%-й и активатора). При смешивании этих компонентов и растворении их в воде образуется диоксид хлора. Изучены концентрации рабочих растворов по диоксиду хлора: 0,01%; 0,05%; 0,075%.

Средство № 2 состоит из компонента 1 (порошка, содержащего хлорит натрия (3%)) и компонента 2 (порошка, содержащего водный раствор соляной кислоты (2%)). При смешивании этих компонентов образуется диоксид хлора. Изучена концентрация рабочего раствора по диоксиду хлора 0,04%.

Изученные рабочие растворы средства № 1 в концентрации 0,05% и средства № 2 в концентрации 0,04% обладают антимикробной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, вирусов (полиомиелита), грибов рода Candida, Trichophyton.

Изучение токсичности и опасности дезинфицирующих средств проводили в соответствии с Руководством¹. Средние смертельные дозы определяли на белых беспородных самках мышей (n = 6). Оценку раздражающего действия на слизистые оболочки глаз проводили на самцах кроликов породы шиншилла (n = 3). Им вносили одну каплю изучаемого раствора в конъюнктивальный мешок глаза.

Для оценки раздражающего действия на кожные покровы также использовали самцов кроликов породы шиншилла (n = 3). Для этого 0,5 мл изучаемого раствора однократно наносили на выстриженный участок кожи боковой поверхности тела животного (7 × 8 см) на 4 ч.

Токсичность рабочих растворов средств изучали в затравочных камерах объёмом 0,5 м³. Исследования проводили на белых беспородных крысах-самках (n = 8/группа, масса тела 280–320 г). Для выявления интоксикации использовали показатели функционального состояния отдельных органов и систем. Функции нервной системы изучали по суммационно-пороговому показателю (СПП)², исследовали поведенческие реакции, которые характеризуют регулирующую, интегрирующую, координирующую функции центральной нервной системы³. В экспериментах использовали тест «открытое поле», позволяющий оценить двигательные компоненты (горизонтальный и вертикальный) ориентировочной реакции, норковый рефлекс, который определяется исследовательским рефлексом, и тест «тёмная камера с отверстиями» (ТКСО), показывающий исследовательскую активность животных, не модулированную страхом.

Для оценки функционального состояния дыхательной системы регистрировали частоту дыхательных движений (ЧДД), поскольку это один из информативных неспецифических параметров. Изменения данного показателя при ингаляционном воздействии летучих химических веществ с выраженными раздражающими свойствами могут быть обусловлены активацией чувствительных окончаний тройничного нерва в слизистой оболочке полости носа. Такая активация вызывает рефлекторные изменения частоты дыхания, опосредованные дыхательным центром.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы SPSS Statistics 22.0. Характер распределения оценивали по критерию Шапиро – Уилка. Оценку различий между группами выполняли при помощи однофакторного дисперсионного анализа с последующим проведением апостериорного теста (поправки Тьюки и Тамхейна). Результаты представляли в виде M ± SD (М — среднее значение, SD — стандартное отклонение). Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.

Белых крыс и мышей получали из питомника лабораторных животных филиала «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Кроликов породы шиншилла получали из питомника лабораторных животных ООО «СМК СТЕЗАР». Всех животных содержали в стандартных контролируемых условиях вивария (температура, влажность, чередование светлого и тёмного периода суток 12/12) со свободным доступом к воде и пище.

Экспериментальные исследования выполнены в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22.09.2010 по охране животных, используемых в научных целях, и одобрены Этическим комитетом (подкомитетом) Института дезинфектологии ФБУН «ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора.

Для оценки ингаляционной опасности дезинфицирующих средств определяли содержание в воздухе диоксида хлора, для чего моделировали условия, близкие к практическому применению.

Ингаляционную опасность рабочего раствора диоксида хлора в концентрации 0,04% (средство № 2) оценивали в помещении объёмом 30 м³ при обработке способом протирания поверхности площадью 23,5 м². Температура в помещении до начала эксперимента —плюс 22 °С, после окончания — плюс 24°С. Пробы отбирали в центре помещения на высоте 100 см от пола. Режим проветривания помещения обеспечивал четырёхкратный обмен воздуха в час.

Определение диоксида хлора в воздухе основано на спектрофотометрическом методе с использованием индикатора хлорфенолового красного [9]. Диапазон измеряемых концентраций составляет 0,00175–0,01754 мг/м³.

Результаты

Изучена токсичность водных рабочих растворов средств № 1 и № 2 в концентрациях от 0,01 до 0,075% по диоксиду хлора. Все рабочие растворы относятся к малотоксичным соединениям: LD₅₀ при введении в желудок более 5000 мг/кг (4-й класс опасности по ГОСТ 12.1.007–76). Рабочие растворы средств в концентрациях 0,01% и 0,04% не обладают раздражающим действием на кожу и слизистые оболочки глаз. Рабочие растворы в концентрациях от 0,05 до 0,075% обладают слабым раздражающим действием на слизистые оболочки глаз и не раздражают кожу.

Для изучения ингаляционного воздействия диоксида хлора на организм крыс рабочие растворы средств № 1 и № 2 вносили в камеру в различных объёмах и концентрациях способом протирания. Норма расхода (N) для всех рабочих растворов составляла 100 мл/м². Контрольным животным в камеру вносили дистиллированную воду. Экспозиция составила 2 часа. После окончания экспозиции у белых крыс регистрировали частоту дыхания, СПП и поведенческие реакции. Результаты исследований приведены в табл. 1–4.

Как следует из приведённых данных, при внесении в камеру 0,075%-го рабочего раствора средства № 1 у животных отмечено урежение частоты дыхания (F = 30,16; р = 0,0001), снижение СПП (F = 10,26; р = 0,0001) и уменьшение числа стоек (F = 4,7; р = 0,009) в тесте «открытое поле» (табл. 2). Рабочие растворы в концентрациях 0,01 и 0,05% не вызывали изменений регистрируемых показателей. Поэтому пары рабочих растворов в концентрации 0,075% в норме расхода можно рассматривать как порог острого действия. Таким образом, зона острого действия (Z_ac) равна 1, и согласно Классификации по степени ингаляционной опасности дезинфицирующих средств по Z_ac рабочий раствор средства № 1 соответствует 2-му классу опасности. Поэтому 0,075%-й рабочий раствор средства № 1 следует рекомендовать для обработки поверхностей при условии применения персоналом средств индивидуальной защиты в отсутствие пациентов и населения.

При изучении рабочих растворов средства № 2 на уровне воздействия паров рабочего раствора в концентрации 0,04% в 12 нормах расхода у опытных животных установлено изменение поведенческих реакций: уменьшалось число стоек (F = 5,83; р = 0,003) и заглядываний в отверстия-норки (F = 4,91; р = 0,007) в тесте «открытое поле», сокращался латентный период первого выглядывания (F = 3,12; р = 0,04) в тесте «ТКСО» (табл. 4). При воздействии паров рабочего раствора в 3 и 10 нормах расхода изменений показателей интоксикации не зарегистрировано. Следовательно, порог острого биоцидного действия рабочего раствора в концентрации 0,04% находится на уровне 12 норм расхода, а Z_ac рабочего раствора равна 12. Таким образом, данный рабочий раствор относится к 4-му классу малоопасных веществ в соответствии с Классификацией степени ингаляционной опасности дезинфицирующих средств по Z_ac, и его можно использовать в присутствии пациентов и населения без применения средств индивидуальной защиты.

Для полной оценки безопасности средства проведено определение диоксида хлора в воздухе помещения, обработанного способом протирания рабочим раствором диоксида хлора с концентрацией 0,04%. Содержание диоксида хлора сразу после обработки помещения составило 0,00178 ± 0,00053 мг/м³, после экспозиции в течение 90 мин — 0,00203 ± 0,00061 мг/м³, после проветривания в течение 30 мин — 0,00191 ± 0,00057 мг/м³ и 60 мин — 0,00148 ± 0,00044 мг/м³. Полученные данные сравнивали с установленными гигиеническими нормативами для диоксида хлора⁴: ПДК в воздухе рабочей зоны 0,1 мг/м³ (1-й класс опасности), ОБУВ в атмосферном воздухе городских и сельских поселений — 0,01 мг/м³. Содержание диоксида хлора в воздухе на всех этапах исследования было значительно ниже установленных нормативов, что позволяет проводить работы с приготовленным рабочим раствором в концентрации 0,04% в присутствии людей и без использования средств индивидуальной защиты. Данные подтверждают результаты исследования, полученные на лабораторных животных при определении зоны острого биоцидного действия этого рабочего раствора.

Обсуждение

Дезинфицирующие средства, основным действующим веществом которых является диоксид хлора, состоят из двух компонентов и представляют собой смесь натриевых и (или) кальциевых солей (хлорид кальция, хлорид натрия, хлорит натрия, карбонат натрия, бисульфат натрия и др.). При смешивании этих компонентов в воде или при добавлении активатора образуется диоксид хлора, который обладает большим окислительным потенциалом и одновременно с этим не выделяет активный хлор в атмосферу.

Важно, что при внесении в камеру 75 мг диоксида хлора рабочего раствора средства № 1 в концентрации 0,075% наблюдали изменение частоты дыхания и поведенческих реакций экспериментальных животных, а при внесении в камеру 400 мг диоксида хлора рабочего раствора средства № 2 в концентрации 0,04% изменений показателей интоксикации не отмечали.

Таким образом, наиболее токсичным оказалось средство № 1, на что, возможно, оказали влияние вспомогательные компоненты и способ получения диоксида хлора.

При использовании средства № 1 процесс получения диоксида хлора основан на взаимодействии хлорита натрия и лимонной кислоты с образованием в качестве побочного продукта избыточного количества свободного хлора по уравнению (1):

15NaClO₂ + 4C₆H₈O₇ → 12ClO₂ + 4C₆H₅Na₃O₇ + 3NaCl + 6H₂O  (1)

В отличие от реакции восстановления хлорита натрия, диоксид хлора, получаемый методом окисления NaClO₂ с соляной кислотой (средство № 2), образуется по уравнению (2):

5NaClO₂ + 4HCl → 5NaCl + 4ClO₂ + 2H₂O  (2)

Это позволяет получить диоксид хлора с высоким выходом конечного продукта при конверсии хлорита натрия и минимальным выходом свободного хлора [10]. Кроме того, свободный хлор способен смещать равновесие химической реакции в присутствии кислот в сторону исходных веществ, что может значительно снизить выход диоксида хлора с образованием побочных хлорсодержащих продуктов и, следовательно, изменить токсикологический профиль средства [11]. Поэтому необходим тщательный выбор компонентов средства для получения диоксида хлора с меньшим количеством побочных продуктов химической реакции.

Наличие свободного хлора в камере при изучении средства № 1 подтверждается при обследовании животных, подвергавшихся воздействию его рабочего раствора в концентрации 0,075%. Как следует из результатов, представленных в табл. 2, у крыс было зарегистрировано снижение частоты дыхательных движений, которое происходит при наличии в камере раздражающего фактора. Таким эффектом могут обладать активные формы хлора, обладающие раздражающим действием [12]. Основные признаки раздражающего действия — слезотечение, ринорея, бронхоспазм, кашель, одышка; у животных первый признак раздражения — урежение частоты дыхания. Поэтому при установлении Lim_ac в качестве неспецифического показателя интоксикации регистрировали частоту дыхательных движений, изменение которой связано с активацией чувствительных окончаний тройничного нерва в слизистой оболочке полости носа.

Нервная система является не только чувствительным индикатором влияния химического соединения на организм, но и интегральным показателем его состояния, поскольку ей принадлежит ведущая роль в поддержании саморегуляции (гомеостаза), защите от неблагоприятных факторов. Для оценки функционального состояния нервной системы при испытании химических веществ, а также в фундаментальных исследованиях изучают нейроповеденческие реакции и патоморфологические нарушения нервной системы. Морфологическое исследование даёт представление об изменениях в нейронах на клеточном уровне, а поведенческие и физиологические методы оценки — о видимых проявлениях нарушения нейронных связей. Первоначальный уровень тестирования предполагает оценку поведения и спонтанной двигательной активности животных. Спонтанная двигательная активность служит обобщающим тестом состояния нервной системы, представляющим собой пик нейронной интеграции, который много лет применяли для оценки воздействия на организм химических и физических факторов. Для регистрации двигательной активности используют тест «открытое поле» [13]. Двигательная активность характеризуется количественными данными: числом пробежек, вставаний и другими показателями. Широкое распространение в токсикологических исследованиях получил достаточно простой и чувствительный метод определения СПП, который отражает одновременно два параметра возбудимости: лабильность нервных центров, влияющую на способность к суммации импульсов при заданном интервале между ними, и порог сгибательного рефлекса. Таким образом, для определения Lim_ac у лабораторных животных использовали неспецифический и интегральные показатели интоксикации диоксидом хлора. На основании этих исследований установлены классы опасности в соответствии с Классификацией степени ингаляционной опасности дезинфицирующих средств по Z_ac.

Заключение

Газообразный диоксид хлора используют в качестве средства защиты от инфекционных болезней, передаваемых воздушно-капельным путём. Также известно, что диоксид хлора в высоких концентрациях обладает токсическим действием. Поэтому было важно установить, какие концентрации диоксида хлора можно использовать для защиты людей без необходимости их эвакуации. При изучении порогов и зон острого биоцидного действия при ингаляционном воздействии различных рабочих растворов дезинфицирующих средств на основе диоксида хлора использовали способ протирания поверхностей. Были определены классы опасности дезинфицирующих средств согласно Классификации степени ингаляционной опасности по Z_ас и даны рекомендации по их безопасному использованию в практике. Рабочий раствор с концентрацией диоксида хлора 0,075% относится ко 2-му классу опасных средств по Классификации степени ингаляционной опасности дезинфицирующих средств по Z_ас и может использоваться специалистами при условии применения средств индивидуальной защиты органов дыхания, глаз, кожи в отсутствие пациентов и населения. Рабочие растворы с концентрацией диоксида хлора 0,05–0,01% относятся к 4-му классу малоопасных средств по Классификации степени ингаляционной опасности дезинфицирующих средств по Z_ас и могут использоваться в присутствии пациентов и в быту. В целом для оценки безопасности применения дезинфицирующих средств рекомендуется проводить комплексное исследование с изучением токсичности на лабораторных животных с целью установления класса опасности и определения содержания действующего вещества в воздухе помещения для безопасного нахождения в нём.

¹Подраздел 6.2 Р 4.2.3676–20 «Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности».

²Сперанский С.В. Определение суммационно-порогового показателя при различных формах токсикологического эксперимента: метод. указания. Новосибирск; 1975.

³МР 1.2.0382–25 Методические рекомендации по оценке поведенческих, когнитивных, эмоциональных, сенсорных функций и социального поведения у животных в токсикологических исследованиях.

⁴СанПиН 1.2.3685–21 «Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания».