Возможность использования крыс линии Вистар как модельного объекта при исследовании влияния воспаления и непредсказуемого стресса на тревожность и циклы «сон — бодрствование»

Введение

Стрессовые реакции представляют собой комплексный защитный механизм, направленный на поддержание гомеостаза при кратковременных экстремальных воздействиях. Однако при хроническом стрессе эти адаптивные механизмы приобретают деструктивный характер, приводя к многочисленным нарушениям здоровья. Спектр нарушений, возникающих вследствие стресса, очень широк: от нейродегенеративных процессов до развития психических расстройств, таких как депрессия и тревожные состояния. Наиболее яркими и заметными признаками развивающейся болезни часто становятся беспокойство, когнитивные расстройства и нарушения сна [1, 2]. Ранняя диагностика позволяет своевременно начать терапию и не допустить резкого прогрессирования болезни. Особую роль в восприимчивости организма к стрессирующим воздействиям играют инфекционные болезни и воспалительные процессы. Воспаление, перенесённое в раннем возрасте, способно существенно повлиять на функционирование гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, иммунной и нервной систем, что приводит к долговременной перестройке защитных механизмов и изменяет устойчивость организма к последующим стрессовым воздействиям, в частности, к хроническому стрессу [3].

Подбор адекватной модели и протокола тестирования поведения на животных необходим для детального изучения механизмов провокации нарушений в работе ЦНС и разработки путей их коррекции. Модель «двойного удара» используется при исследовании причин и механизмов возникновения болезней ЦНС [4]. Эта модель включает последовательное воздействие двух неблагоприятных факторов — в раннем постнатальном периоде и в подростковом или взрослом возрасте. Такие комплексные модели позволяют изучать взаимодействие факторов, приближенных к реальным условиям жизни человека, и способствуют углублённому пониманию механизмов развития стресс-ассоциированных патологий и других физиологических нарушений. В последние годы данная модель активно используется для изучения патогенеза депрессивных и тревожных расстройств.

В научной литературе отмечено, что дикие серые крысы (Rattus norvegicus) и лабораторные крысы линии Вистар, несмотря на принадлежность к одному виду, демонстрируют значительные различия в устойчивости к внешним воздействиям. Дикие особи обладают повышенной резистентностью к неблагоприятным факторам среды, что обусловлено естественным отбором, обеспечивающим сохранение наиболее адаптивных генотипов. А лабораторные крысы, на протяжении множества поколений содержащиеся в контролируемых условиях, подвергались искусственному отбору, не направленному на поддержание адаптивных функций организма, что и привело к снижению их общей устойчивости к стрессорам. Тем не менее, несмотря на выраженные признаки доместикации, лабораторные крысы сохранили способность, хотя и ослабленную, противостоять негативным воздействиям в процессе онтогенеза.

Целью данной работы было исследование влияния «двойного удара» на уровень тревожности и продолжительность циклов «сон – бодрствование» у крыс линии Вистар. В нашем исследовании в качестве «первого удара» использовались инъекции липополисахарида (ЛПС) (бактериального эндотоксина, активирующего реакции врождённой системы иммунитета) в неонатальном периоде, а в качестве «второго удара» — субхроническое непредсказуемое стрессирующее воздействие.

Материалы и методы

Работу проводили на детёнышах белых крыс линии Вистар обоего пола. Всего в экспериментах было использовано 83 крысы (40 самок и 43 самца). Все манипуляции с животными были выполнены согласно принципам гуманности, изложенным в директиве Совета Европейского Союза (86/609/ЕЭС), и ГОСТ 33216–2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными». Работа одобрена комиссией по биоэтике МГУ (протокол № 194-ж от 26.12.2024).

После рождения детёныши крыс были разделены на две группы. На 7-й и 9-й постнатальные дни (ПНД) животным опытной группы внутрибрюшинно вводили ЛПС в дозе 50 мкг/кг, контрольной группе — воду для инъекций. На 31-й ПНД проводили оценку уровня тревожности в тесте «О-образный лабиринт» [5]. С 34-го по 39-й ПНД половину животных из каждой группы подвергали субхроническому непредсказуемому стрессу (СНС). Применяли следующие стрессирующие факторы: принудительное плавание, иммобилизация, яркое освещение, мокрый подстил, скученность и питьевая депривация. Стрессирование проводили по методике, описанной М. Papp и соавт. [6].

Таким образом, в дальнейших экспериментах использовали 4 группы крыс: подвергавшиеся воспалению и стрессирующему воздействию (ЛПС + СНС); получавшие ЛПС, но не подвергавшиеся СНС (ЛПС); перенёсшие стресс, но не получавшие ЛПС неонатально (СНС); контрольные (Контроль).

Через 1 сутки после окончания СНС (40-й ПНД) оценивали уровень тревожности животных в приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ) в условиях контрастного освещения рукавов лабиринта по методике, описанной в нашей предыдущей работе [7].

При достижении животными возраста трёх месяцев в каждой группе случайным образом были выбраны четыре самца, которым субдурально вживляли нихромовые электроды. Электроды располагали по два над лобной и теменной корой и один референтный электрод в ростральной части лобной кости.

Через пять дней после операции начинали непрерывную круглосуточную регистрацию полисомнограммы (ПСГ), включающей два канала ЭЭГ и запись механограммы с помощью акселерометра. Каждое животное было подсоединено гибким кабелем к усилителю биопотенциалов (конструкции А.А. Трощенко), снабжённому трёхмерным акселерометром. Такая конструкция позволяет регистрировать ПСГ, не ограничивая свободу перемещений животного, и даёт возможность усилителю биопотенциалов со встроенным акселерометром свободно колебаться в трёх плоскостях, реагируя даже на небольшие движения крысы. Визуальный полуавтоматический анализ полученных данных ПСГ по 20-секундным эпохам проводили с помощью специальной программы, созданной на базе EDF-браузера с открытым кодом [8].

При статистической обработке данных использовали программу Statistica 10.0 (StatSoft Inc, 2013). Для проверки нормальности распределения применяли критерий Шапиро – Уилка. Если анализ выборок показывал, что распределение соответствует критериям нормального, для дальнейшей обработки использовали дисперсионный анализ (ANOVA). При отличном от нормального распределении выборок использовали непараметрический критерий Манна – Уитни. Для сравнения связанных выборок (при оценке циклов «сон – бодрствование») применяли парный t-тест, поскольку распределение в данном случае было нормальным (по критерию Шапиро – Уилка). Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

Статистическая обработка результатов исследования поведения животных в тестах «О-образный лабиринт» и ПКЛ с помощью двухфакторного ANOVA не выявила достоверного влияния фактора ПОЛ (F < 0,14; p > 0,71), а также взаимодействия факторов ПОЛ/Группа (F < 0,78; p > 0,38), что позволило представить данные по всей выборке крыс.

При оценке уровня тревожности животных в тесте «О-образный лабиринт» не было выявлено значимых различий между опытной и контрольной группами (p > 0,15; критерий Манна – Уитни; рис. 1). Таким образом, неонатальное воспаление, вызванное введением ЛПС, не влияло на тревожность крыс на 31-й ПНД. Перед началом стрессирующего воздействия уровень тревожности у всех животных был одинаковым.

Через 1 сутки после окончания СНС исследовали уровень тревожности крыс в тесте ПКЛ. Было выявлено достоверное влияние фактора СНС (F_{(1, 73)} = 4,08; p = 0,047), однако не установлено значимого влияния фактора ЛПС (F_{(1, 73)} = 0,40; p = 0,52) и взаимодействия факторов ЛПС/СНС (F_{(1, 73)} = 0,07; p = 0,79). Все животные, подвергавшиеся стрессирующему воздействию (группы СНС и ЛПС+ СНС), больше времени проводили на свету и чаще выходили в центр лабиринта по сравнению с нестрессированными крысами (группы ЛПС и Контроль) (рис. 2). Возможно, субхронический стресс привёл к развитию у животных гиперактивности и повышенной импульсивности [9].

Анализ циклов «сон – бодрствование» выявил достоверные отличия в продолжительности дневного и ночного бодрствования между группами Контроль и ЛПС. У крыс, подвергавшихся СНС, различия в продолжительности бодрствования днём и ночью проявлялись только на уровне тенденции (р < 0,1; рис. 3).

Обсуждение

Показано, что раннее постнатальное воспаление, вызванное введением ЛПС, не оказывает отставленного влияния на тревожность крыс, а также продолжительность и структуру циклов «сон – бодрствование». В то же время непредсказуемое стрессирующее воздействие в предпубертатном периоде приводит к развитию гиперактивности и вызывает небольшие, но долговременные нарушения в циклах «сон – бодрствование». Схожие, но более выраженные реакции на подобные воздействия наблюдаются и у человека [10].

Несмотря на то, что серая крыса (Rattus norvegicus) в естественных условиях демонстрирует высокую адаптированность к изменениям окружающей среды и устойчивость к стрессовым воздействиям, лабораторные линии крыс (в частности, линия Вистар) представляют релевантную модель для экстраполяции экспериментальных данных на человека [11]. Это обусловлено длительной доместикацией лабораторных крыс и содержанием их в контролируемых условиях вне естественного отбора, что привело к снижению адаптивного потенциала. В результате лабораторные крысы, подобно современному человеку, существуют в искусственно стабилизированной среде, что делает их более чувствительными к внешним воздействиям по сравнению с дикими сородичами.

Таким образом, несмотря на изначально высокую биологическую пластичность вида Rattus norvegicus, лабораторные линии крыс являются адекватной моделью для изучения физиологических, нейробиологических и патологических процессов, актуальных для человеческой популяции. Данный подход подтверждается высокой степенью гомологии ключевых молекулярных и системных механизмов регуляции у грызунов и приматов [12].

В нашем исследовании особое внимание уделено анализу циклов «сон – бодрствование», поскольку нарушения сна являются одним из ключевых маркёров стресс-индуцированных расстройств [1]. Известно, что хронический стресс приводит к характерным изменениям архитектуры сна, в том числе к сокращению продолжительности медленноволнового сна и увеличению числа пробуждений [10, 13].

Заключение

Лабораторные линии крыс являются адекватной моделью для изучения различных процессов, актуальных для человеческой популяции. Наши результаты показали наличие нарушений продолжительности сна у животных, перенёсших стрессирующее воздействие, что также подтверждает возможность использования крыс линии Вистар для моделирования стресс-индуцированных расстройств у человека.