Оценка цитотоксичности наночастиц оксида железа различной модификации, легированных серебром, на клеточных культурах in vitro

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы новые материалы, созданные на основе нанотехнологий, находят широкое применение в различных областях медицины. Одно из наиболее перспективных направлений — получение и изучение наночастиц оксида железа (НЧ Fe₂O₃), обладающих рядом уникальных свойств, отличающих эти частицы от макроразмерного аналога. При уменьшении размера частиц увеличивается удельная поверхность, что приводит к усилению каталитической активности [1]. Данное свойство оказывает влияние на их взаимодействие с биомолекулами живых клеточных систем, в том числе бактериальных клеток и вирусных частиц. Важными отличительными особенностями НЧ являются супермагнитные свойства, которые позволяют управлять ими во внешнем магнитном поле, что открывает перспективы при визуализации процессов, происходящих в клетке [2, 3]. Также при температурной обработке частицы серебра, которые наносят на поверхность Fe₂O₃, лучше «приживаются»: формируется более равномерное и прочное покрытие [4]. Это критично для проявления синергизма: серебро само по себе обладает каталитической активностью и антибактериальными свойствами, а матрица из Fe₂O₃ даёт магнитные свойства и большую площадь поверхности. Их взаимодействие (электронное, на границе раздела фаз) усиливает общие характеристики композита. Добавление серебра к НЧ приводит к нарушению работы ферментов бактерий, а Fe₂O₃ даёт сильный антибактериальный эффект. Такие материалы перспективны для медицинских покрытий (катетеры, инструментарий, поверхности), фильтров воды или тканей.

Вышеописанные свойства НЧ Fe₂O₃ делают их весьма интересными объектами для разработки и апробации новых подходов в области дезинфектологии. Так, предложен новый подход к разработке защитных медицинских перчаток с антимикробными свойствами [5] на основе наночастиц оксидов металлов, в частности оксида цинка ZnO различной морфологической модификации [6], что открывает широкие перспективы в борьбе с инфекциями, связанными с медицинской помощью (ИСМП). Рост числа устойчивых к современным антибиотикам и дезинфицирующим средствам госпитальных штаммов микроорганизмов диктует необходимость поиска новых антимикробных наполнителей. В первую очередь это касается отделений высокого риска развития ИСМП¹, где применение защитных перчаток с антимикробным эффектом будет наиболее востребованным [7]. При этом важно учитывать не только эффективность противомикробных компонентов, но и потенциальное влияние новых наполнителей на здоровье медицинского персонала, пациентов и окружающую среду.

В число наиболее изученных наноматериалов входят время НЧ Fe₂O₃, о чём свидетельствуют многочисленные работы, демонстрирующие их эффективность в целевой доставке лекарственных средств, и применение в магнитной гипертермии при лечении злокачественных новообразований [8]. Ряд препаратов на основе НЧ Fe₂O₃ уже прошёл клинические испытания и получил одобрение Управления по контролю за продуктами и лекарствами США [9]. Тем не менее недостаточно изучено взаимодействие НЧ Fe₂O₃ с живыми организмами.

Один из этапов современной оценки токсичности химических веществ – эксперименты на клеточных культурах [10]. Доказано, что цитотоксичность зависит от множества факторов, связанных с самим веществом (размер, форма, концентрация вещества, степень агрегации, наличие или отсутствие покрытия НЧ и др.), и от особенностей используемых биологических моделей [11–13]. На примере клеток эндотелия пупочной вены человека (HUVEC) установлено, что НЧ Fe₂O₃ могут проявлять цитотоксические свойства, индуцируя окислительный стресс с повреждением ДНК и нарушением цикла клеток [14]. В исследованиях на эпителиальных клетках лёгких А549 показано, что токсичность некоторых НЧ Fe₂O₃ (размером менее 100 нм) возрастала относительно микрочастиц (размером более 5 мкм) с уменьшением размеров структур [15]. Определили, что НЧ Fe₂O₃ с хитозановым покрытием проявляли большую токсичность в отношении раковых клеток (гепатоцеллюлярной карциномы HEP G2) без такого покрытия [16]. В то же время приведены данные о том, что НЧ Fe₂O₃ с галлат-модификацией (покрытые галловой кислотой) обладают лучшей биосовместимостью по сравнению со стандартными аналогами [17].

Целью исследования было изучение на клеточных культурах MDCK и Vero цитотоксичности трёх видов НЧ Fe₂O₃, легированных серебром, и полученных радиационно-химическим методом при различной температурной обработке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования стали три экспериментальных образца НЧ Fe₂O₃, изученные с использованием клеточных линий MDCK и Vero.

Наночастицы

Модифицированные НЧ Fe₂O₃ синтезированы в Институте электрофизики Уральского отделения Российской академии наук в виде водных суспензий НЧ Fe₂O₃, покрытых серебром, диаметром 20–30 нм и полученных радиационно-химическим методом с последующим ступенчатым отжигом:

• образец НЧ Fe₂O₃ S0, без дополнительной температурной обработки;
• образец НЧ Fe₂O₃ S200, отожжённых при температуре 200°С;
• образец НЧ Fe₂O₃ S500, отожжённых при температуре 500°С.

Клеточные линии

Для получения более надёжной оценки действия исследуемых образцов НЧ Fe₂O₃, эксперимент проводили на двух клеточных линиях. Культуры получены из Коллекции банка клеточных культур ФБУН ФНИИВИ «Виром» Роспотребнадзора.

MDCK — гетерогенная эпителиальная клеточная линия, выделена в 1958 г. в США из почки взрослой собаки. Клеточная линия относится к перевиваемым клеточным культурам, морфологически имеет эпителиоподобную полигональную или кубическую форму, и округлые ядра, расположенные в центре. Клетки формируют плотный монослой. Благодаря своим физиологическим особенностям, характерным для клеток эпителиальных тканей, MDCK используют для изучения эпителиальной полярности и трансэпителиального транспорта. MDCK также широко применяют для выделения вирусных патогенов (вируса гриппа А, В, С, энтеровируса Коксаки В-5, реовируса, аденовируса 4-го, 5-го типов, вируса чумы собак и др.).

Клеточная линия Vero выделена в Японии (1962 г.) из почки африканской зелёной мартышки. Культура классифицируется как перевиваемая, морфология клеток характеризуется вытянутой веретенообразной формой, с крупным овальным ядром. Присутствуют выраженные межклеточные контакты, в процессе роста клетки образуют плотный монослой. Одним из биологических свойств данной линии является отсутствие экспрессии генов интерферона I, что позволяет использовать Vero для культивирования различных видов вирусов.

Культивирование клеток проводили с использованием питательной среды Игла МЕМ с солями Эрла (HiMedia, США), обогащённой эмбриональной бычьей сывороткой 10%-й (Biosera), для линий Vero и среды α-MEM и с 7%-й сывороткой — для линии MDCK. Восстановление культур клеток после криоконсервации осуществляли по стандартной методике². Субкультивирование проводили по мере формирования монослоя с коэффициентом рассева согласно паспорту клеточной культуры. Для оценки токсического воздействия НЧ Fe₂O₃ в различных модификациях клетки засевали в 96-луночные культуральные планшеты (SPL Life Sciences, Республика Корея) из расчёта посадочной дозы 2 × 10³ кл/лунку. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 37°С во влажной атмосфере с содержанием 5% СО₂.

Для оценки цитотоксичности использовали два метода: морфологический анализ клеточного монослоя и МТТ-тест.

Морфологический анализ монослоя клеток

Суспензии (на основе физиологического раствора (0,85 NaCl) НЧ Fe₂O₃ вносили в лунки планшета с клеточным монослоем методом серийных двукратных разведений. В первую лунку добавляли 200 мкл суспензии с исходной концентрацией 400 мкг/мл, после чего в шесть последующих лунок предварительно вносили по 100 мкл питательной среды Игла МЕМ или α-MEM — в зависимости от клеточной культуры. Из первой лунки отбирали 100 мкл суспензии и последовательно переносили в следующую, тщательно перемешивая на каждом шаге, тем самым уменьшая концентрацию вдвое. Для корректной оценки влияния НЧ на морфологию клеточного монослоя были предусмотрены два контроля. Первый контроль — монослой клеток без НЧ с физиологическим раствором (в том же объёме и при тех же условиях, что и в экспериментальных сериях). Второй контроль был направлен на то, чтобы оценить базовый фон, то есть состояние клеток в условиях, когда на них не действуют ни НЧ, ни дополнительные компоненты среды. Для этого использовали лунки с клеточным монослоем, добавляя питательную среду без сыворотки. Экспозиция клеток составляла 24, 48, 72 ч при стандартных условиях культивирования.

Наблюдение за морфологическими изменениями клеточного монослоя проводили в динамике через 24 ч, 48 ч и 72 ч с момента внесения НЧ Fe₂O₃. Оценку выполняли с помощью инвертированного микроскопа Primovert (Zeiss, Германия) при увеличении 200 × 10. Обязательным условием была оценка состояния клеток в контрольной группе. Учитывали следующие параметры: соответствие клеток их нормальной морфологии (форме, зернистости цитоплазмы и др.), целостность клеточного монослоя, наличие или отсутствие клеточного детрита. Степень изменений, произошедших под влиянием НЧ Fe₂O₃, оценивали по балльной системе (табл. 1) согласно стандарту ГОСТ ISO 10993–5–2023³.

Оценка цитотоксичности по показателю дегидрогеназной активности с помощью МТТ-теста

Клетки высевали в 96-луночный культуральный планшет и инкубировали до достижения монослоя (примерно 70% конфлюэнтности), затем в лунки добавляли испытуемые НЧ по 100 мкл в концентрациях от 1 × 10^–¹ мг/мл до 1 × 10^–⁶ мг/мл, разведённые в питательной среде. В качестве контроля использовали питательную среду, которую добавляли в лунки в том же объёме. Оценку цитотоксичности каждой концентрации выполняли в трёх повторностях.

После окончания инкубации клеток с НЧ Fe₂O₃ в течение 24 ч и удаления питательной среды каждую лунку трижды промывали фосфатным буфером. Затем вносили 100 мкл раствора МТТ в концентрации 1 мг/мл, после чего планшеты инкубировали при стандартных условиях в течение двух часов. После удаления среды образовавшиеся в лунках кристаллы формазана растворяли путём добавления 200 мкл органического растворителя ДМСО в каждую лунку и тщательно суспензировали. Далее проводили измерения оптической плотности полученных растворов с помощью микропланшетного ридера AMR-100 (Allsheng, Китай) при длине волны 570 нм. На основе полученных данных рассчитывали индекс цитотоксичности (IC) по следующей формуле:

где ОПк — оптическая плотность раствора формазана контрольной группы; ОПо — оптическая плотность раствора формазана опытной группы.

Полученные экспериментальные данные также использовали для расчёта концентрации полумаксимального ингибирования (IC₅₀) методом линейной интерполяции. Определяли концентрацию НЧ Fe₂O₃, приводящую к 50-процентному ингибированию роста клеточной культуры. Статистический анализ данных оптической плотности выполнен с использованием критерия Манна – Уитни. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ Microsoft Excel и Jamovi 2.6.26. Различия считали значимыми при p < 0,05. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (M ± SD).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ результатов влияния НЧ Fe₂O₃, полученных при различной температурной обработке, на клеточной линии Vero показал, что НЧ Fe₂O₃ S0 оказывали наиболее выраженное среди всех тестируемых образцов цитотоксическое воздействие. В диапазоне концентраций 6,25–100 мкг/мл изменения в монослое отсутствовали, морфология клеток не отличалась от группы контроля. В концентрации 200 мкг/мл наблюдали значительное изменение морфологии клеток, в том числе появление округлых клеток и зернистости в цитоплазме, что может свидетельствовать о клеточном стрессе или начальных стадиях апоптоза (3 балла). При этом 30% клеток сохраняли нормальную морфологию. Дальнейшее повышение концентрации до 400 мкг/мл приводило к их полной гибели: всё поле зрения было заполнено клеточным детритом (4 балла).

Образцы НЧ Fe₂O₃ S200 и НЧ Fe₂O₃ S500 оказывали менее выраженное цитотоксическое воздействие. У НЧ Fe₂O₃ S200 в концентрации 50 мкг/мл и ниже видимое воздействие на клеточную культуру отсутствовало. При повышении концентрации до 100 мкг/мл в поле зрения наблюдали единичные видоизменённые клетки, а при концентрации 200 мкг/мл определяли умеренное воздействие на клеточный монослой в виде нарушения структуры: в 30% встречали повреждённые клетки с уменьшением их размера (2 балла). Дальнейшее увеличение концентрации до 400 мкг/мл приводило к более значительным дегенеративным изменениям — лизису 50% клеток (3 балла). Воздействие НЧ Fe₂O₃ S500 в концентрациях 100 мкг/мл и ниже также не оказывало видимого влияния на клетки Vero, при концентрации 200 мкг/мл наблюдалось незначительное изменение монослоя (1 балл), тогда как концентрация 400 мкг/мл вызывала нарушение целостности монослоя, доля разрушенных клеток не превышала 70% (3 балла).

Исследование влияния трёх типов НЧ Fe₂O₃ (S0, S200 и S500) на морфологию монослоя клеточной линии Vero через 24, 48 и 72 ч после введения суспензии не выявило существенных различий в клетках по мере увеличения экспозиции. Морфологические показатели оставались сопоставимыми с аналогичным вариантом для каждого образца в соответствующей концентрации. Таким образом, в ходе эксперимента установлен дозозависимый эффект, тогда как временная динамика в интервале 24–72 ч отсутствовала.

При оценке влияния НЧ Fe₂O₃ на клеточную линию MDCK в отношении морфологии получены сопоставимые результаты с клеточной линией Vero. Наиболее выраженный цитотоксический эффект проявляли НЧ Fe₂O₃ S0. В диапазоне концентраций 6,25–50 мкг/мл данного образца отсутствовало видимое влияние на клеточный монослой, тогда как при взаимодействии НЧ Fe₂O₃ S0 с клеточной линией у 80% клеток сохранялась нормальная морфология (1 балл). Повышение концентрации до 200 и 400 мкг/мл приводило к разрушению монослоя от 90 до 100% (4 балла). Образцы Fe₂O₃ S200 и Fe₂O₃ S500 оказывали менее выраженное токсическое воздействие на MDCK, их влияние прослеживалось лишь при концентрации 400 мкг/мл. При этом НЧ Fe₂O₃ S200 в указанной концентрации вызывали умеренное воздействие на клетки: образование рыхлого монослоя с появлением не более 70% лизированных клеток (3 балла). С образцом Fe₂O₃ S500 при концентрации 400 мкг/мл наблюдали дегенеративные изменения структуры клеточного монослоя (не более 50% клеток) и уменьшение размеров клеток (2 балла). Стоит отметить, что временная динамика влияния НЧ Fe₂O₃ в интервале 24–72 ч на клеточную линию MDCK, как и на клетки Vero, отсутствовала. Контрольные лунки с клеточным монослоем оставались без изменений.

Дополнительно цитотоксичность НЧ Fe₂O₃ трёх типов (S0, S200 и S500) была исследована на клеточных линиях MDCK и Vero с использованием МТТ-теста в диапазоне концентраций от 6,25 до 400 мкг/мл с оценкой индекса цитотоксичности (IC₅₀).

Статистический анализ данных, выполненный с использованием критерия Манна–Уитни, показал, что для клеточной линии MDCK статистически значимые различия относительно контрольной группы наблюдались у образцов НЧ Fe₂O₃ S0 при концентрации 200 мкг/мл (опыт: 0,824 ± 0,082 (n = 3), контроль: 1,419 ± 0,023; р = 0,050), при концентрации 400 мкг/мл (опыт: 0,205 ± 0,029 (n = 3), контроль: 1,419 ± 0,023; р < 0,001) и у НЧ Fe₂O₃ S500 при концентрации 400 мкг/мл (опыт: 0,561 ± 0,230 (n = 3), контроль: 1,348 ± 0,003; р = 0,050) (табл. 2).

Наблюдаемая тенденция носила дозозависимый характер: при снижении концентрации НЧ степень подавления показателя уменьшалась, достигая значений, близких к контрольным, при концентрациях 100–0 мкг/мл.

Для образца Fe₂O₃ S200 статистически значимых различий с контрольной группой не выявлено ни при одной из исследуемых концентраций (от 6,25 до 400 мкг/мл), что указывает на отсутствие цитотоксического воздействия данного образца в исследуемом диапазоне.

Значения IC₅₀ были рассчитаны методом линейной интерполяции. Для НЧ Fe₂O₃ S0 при 400 мкг/мл составил 220 мкг/мл (до ~14% от контроля), для образцов НЧ Fe₂O₃ S200 ингибирующего эффекта практически нет, сохраняя жизнеспособность на уровне ~80–90% даже при максимальной концентрации IC₅₀ > 400 мкг/мл и для НЧ Fe₂O₃ S500 при 400 мкг/мл до ~ 42%.

Статистически крайне значимые различия относительно контрольной группы наблюдались в показателях оптической плотности для клеточной линии Vero при концентрации 200 мкг/мл для образца НЧ Fe₂O₃ S0 (опыт: 1,018 ± 0,07 (n = 3), р < 0,05; контроль: 0,881 ± 0,133) и для всех исследуемых образцов НЧ при концентрации 400 мкг/мл: НЧ Fe₂O₃ S0 (опыт: 0,449 ± 0,052 (n = 3), контроль: 0,755 ± 0,006; р < 0,001), у НЧ Fe₂O₃ (опыт: 0,353 ± 0,0,004 (n = 3), контроль: 0,811 ± 0,031; р <0,001), у НЧ Fe₂O₃ S500 (опыт: 0,330 ± 0,026 (n = 3), контроль: 0,869 ± 0,049; р < 0,001) (табл. 3). При более низких концентрациях достоверных отличий от контроля не обнаружено.

Для трёх типов НЧ IC₅₀ оказалась выше 400 мкг/мл, при этом в ряде точек относительная жизнеспособность клеток достигала 117%, что свидетельствует об отсутствии ингибирующего эффекта.

Результаты МТТ-теста для клеточных линий MDCK и Vero продемонстрировали низкую или умеренную токсичность исследуемых НЧ Fe₂O₃ S0, Fe₂O₃ S200 и Fe₂O₃ S500 в диапазоне концентраций до 200 мкг/мл. Также в этом диапазоне концентрации не было выявлено морфологических изменений клеток, они сохраняли нормальную форму, плотность, что подтверждает отсутствие существенного повреждающего воздействия. Для образцов НЧ Fe₂O₃ S200 и Fe₂O₃ S500 вплоть до концентрации 200 мкг/мл морфология клеток оставалась практически идентичной контролю НЧ Fe₂O₃ S0, что согласуется с высокой жизнеспособностью, обнаруженной по результатам МТТ-теста. Однако при более высоких концентрациях 400 мкг/мл наблюдалось расхождение между результатами снижения жизнеспособности в МТТ-тесте (умеренное снижение) и морфологическими данными (4 балла), особенно для образца Fe₂O₃ S0. Так, для НЧ Fe₂O₃ S0 в концентрации 200 мкг/мл жизнеспособность по МТТ-тесту оставалась на уровне 70% клеток, при этом микроскопия демонстрировала появление округлых клеток, зернистости цитоплазмы и признаки стрессовой реакции у значительной части популяции (3 балла). При концентрации 400 мкг/мл по МТТ-тесту показатель свидетельствовал об умеренном снижении, тогда как морфология указывала на 100%-ю гибель клеток и наличие клеточного детрита по всему полю зрения (4 балла).

ОБСУЖДЕНИЕ

Выявленное нами несоответствие результатов, полученных различными методами (морфологический анализ монослоя и МТТ-тест), могло быть связано с несколькими причинами. МТТ-тест отражает метаболическую активность митохондрий, а не структурную целостность клеток, поэтому ранние морфологические изменения в клетке не всегда сопровождаются мгновенным снижением их метаболизма. На оптические измерения прибора могли оказать влияние физические свойства наночастиц, создавая как ложное повышение, так и снижение регистрируемого сигнала. Наблюдавшиеся при этом пики жизнеспособности при средних концентрациях могли быть обусловлены и компенсаторными реакциями клеток, и взаимодействием частиц с реактивом МТТ.

Вместе с тем используемые методики согласованно свидетельствовали о наиболее выраженном токсическом действии НЧ Fe₂O₃ S0 на обе клеточные культуры образца, тогда как НЧ Fe₂O₃ S200 и НЧ Fe₂O₃ S500 оказывали значительно меньшее влияние в сопоставимых концентрациях. Такой профиль токсичности может быть обусловлен различиями в размере, степени агломерации и поверхностных свойствах самих наночастиц в связи с условиями синтеза и температурой обжига. Более плотная и менее реакционноспособная поверхность НЧ Fe₂O₃ НЧ S200 и НЧ Fe₂O₃ S500 могла снижать их взаимодействие с клеточной мембраной и структурами клетки, ответственными за метаболизм.

Несмотря на то, что клеточные линии MDCK и Vero демонстрировали сходные дозозависимые эффекты, в обеих моделях временную зависимость цитотоксического действия определить не удалось: отсутствовали морфологические изменения через 24, 48 и 72 часа в пределах каждой концентрации. Высока вероятность того, что основной процесс повреждения в клетке развивается в первые часы после экспозиции и не усиливается при дальнейшей инкубации. Это обусловливает необходимость дальнейших научных исследований.

Важные ограничения выполненного исследования, оказывающие влияние на полученные результаты, обусловлены свойствами НЧ Fe₂O₃. Как и все металлы, они плохо диспергируются в жидкости, что может приводить к формированию агломератов, их оседанию на поверхность клеток и формированию локальных зон перегрузки. Морфологические данные в этом контексте стали важным независимым ориентиром, позволяющим выявить сильные разрушения монослоя там, где МТТ-тест давал сглаженные или нерегулярные дозозависимые кривые.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования токсического влияния НЧ Fe₂O₃ различной модификации на клеточные культуры (Vero и MDCK) с использованием различных методов оценки (морфологический анализ и МТТ-тест) позволили установить зависимость от концентрации и температурного режима обработки НЧ. Наиболее токсичным оказался образец НЧ Fe₂O₃ S0, который в клетках двух типов вызывал выраженную деструкцию клеточного монослоя при концентрации 200 мкг/мл (3 балла на клетках Vero и 4 балла на MDCK). НЧ Fe₂O₃S200 и НЧ Fe₂O₃ S500 проявляли значительно меньшую токсичность и оказывали заметное морфологическое воздействие только в концентрации 400 мкг/мл. Результаты МТТ-теста для обеих клеточных линий MDCK и Vero продемонстрировали низкую или умеренную токсичность исследуемых наночастиц в диапазоне концентраций до 200 мкг/мл. Профиль токсичности позволяет предположить, что температура обжига при синтезе НЧ Fe₂O₃ может быть ключевым фактором, влияющим на их взаимодействие с клеточными культурами, поскольку при разных температурах формируются разные кристаллические фазы оксида железа. Например, при нагреве до температуры выше 400°C метастабильная фаза γ-Fe₂O₃ (маггемит) переходит в более стабильную α-Fe₂O₃ (гематит), а эти фазы имеют разные магнитные и электронные свойства [18]. Поэтому важно, как частица будет взаимодействовать с клеточной мембраной (электростатические силы, адсорбция белков), какие биохимические реакции запустит внутри клетки.

Расхождения в результатах обусловлены тем, что МТТ-тест фиксирует метаболическую активность, а не структурные повреждения клеток, поэтому ранние морфологические изменения могут не отражаться на показателях жизнеспособности. Кроме того, физические свойства наночастиц способны искажать оптические измерения, провоцируя ложные пики сигнала.

В связи с этим для успешного создания материалов на основе наночастиц оксидов металлов необходимы стандартные протоколы оценки их цитотоксичности и эффективности для последующего внедрения в практику здравоохранения.

¹ Брико Н.И., Фельдблюм И.В., Зуева Л.П. и др. Организация и проведение эпидемиологического наблюдения и микробиологического мониторинга в учреждениях родовспоможения: Федеральные клинические рекомендации. М., 2015. 83 с.

² Методы культивирования клеток/ под ред. Г.П. Пинаева, М.С. Богдановой. СПб.; 2008. 278 с.

³ ГОСТ ISO 10993–5–2023. Межгосударственный стандарт «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследования на цитотоксичность методами in vitro».